一、細(xì)胞培養(yǎng)篩查

細(xì)胞應(yīng)長滿90%以上。細(xì)胞上清可直接用于支原體檢查，無需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質(zhì)，此時有必要進(jìn)行DNA抽提。未有證據(jù)表明，細(xì)胞培養(yǎng)基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測的靈敏度的情況。

細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體數(shù)量平均為1×10^6/ml，至多為1×10^8/ml，足以滿足PCR的檢測要求。PCR的模板制備如下：

1.轉(zhuǎn)移500μl細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml EP管，蓋緊蓋。

2.樣本孵育95℃10分鐘。

3.樣本最大轉(zhuǎn)速離心（15s）以沉淀細(xì)胞碎片。

4.取2μl直接用于qPCR，或樣品儲存在4℃，最多6天。長期保存在-20℃。

二、符合藥典的樣品檢查

1、濃縮樣品（可選步驟）

樣品基質(zhì)可能對檢測方法的靈敏度有至關(guān)重要的影響。進(jìn)一步提高檢測靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細(xì)胞培養(yǎng)上清(例如，Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl)，并執(zhí)行樣品濃縮步驟。

①轉(zhuǎn)移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。

②離心≥10000 × g 15分鐘（或≥13000× g  6分鐘），以沉淀支原體顆粒。

③棄掉上清，用200ml Tris緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.4）重懸沉淀。

④樣本渦旋混勻，然后直接進(jìn)行樣本穩(wěn)定化處理或DNA抽提。

2.樣品穩(wěn)定化

細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶，即使在較低的溫度下也會降解支原體DNA。因此，我們建議采取以下步驟來穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進(jìn)行DNA提取，則不需要此步驟。請注意，在樣品濃縮步驟之前，不能通過熱失活來穩(wěn)定樣品。

①轉(zhuǎn)移500ml細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。

②95℃孵育10分鐘。

③最大速度進(jìn)行樣本離心（15秒），以沉淀細(xì)胞碎片。

④樣本即可用于DNA抽提，或儲存在4℃，最多6天。長期保存在-18℃以下。

3.DNA 抽提

大量證據(jù)表明，DNA抽提可實現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦：

Venor®GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗證，具體流程參見試劑盒說明書。

??由于細(xì)胞團塊對PCR反應(yīng)的負(fù)面影響，不能直接使用細(xì)胞團塊進(jìn)行檢測。因此，細(xì)胞團塊，或其他生物材料，如疫苗、冷凍儲存和石蠟包埋的樣品，需要在PCR前提取DNA。

已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結(jié)果，這些樣品可能需要在PCR之前，也需要進(jìn)行DNA提取。

Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat：No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取

??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細(xì)胞。因此，應(yīng)避免在樣品濃縮之前進(jìn)行“樣品穩(wěn)定"，即不能再濃縮前進(jìn)行任何破壞細(xì)胞的程序(如熱失活)，請參見“2.樣品穩(wěn)定化"。可直接處理體積為200 μl的樣品，無需濃縮步驟。

??Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟。

??樣本濃縮時不要加內(nèi)控DNA。

??內(nèi)控DNA可單獨購買（貨號11-9905）。

??PCR抑制可能因樣本基質(zhì)或者洗脫液產(chǎn)生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備，其他品牌試劑盒需要經(jīng)過試驗以保證合格。