支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

如果受到支原體污染時(shí)，細(xì)胞形態(tài)較之無明顯變化，極易被忽視，往往直到污染非常嚴(yán)重時(shí)才能發(fā)現(xiàn)。受污染的細(xì)胞膜上可能有幾百個(gè)支原體，這些支原體競(jìng)爭營養(yǎng)并釋放有毒的代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

『支原體qPCR檢測(cè)試劑盒』介紹

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針法檢測(cè)），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

此兩類試劑盒較其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下*的優(yōu)點(diǎn)：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡單，易于觀察。

（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無交叉反應(yīng)）

 

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

 

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。

②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)高靈敏度。

推薦：Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

a. 凍干粉溶解

 

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

 

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

 

第3步：啟動(dòng)熒光定量PCR儀

 

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。