細(xì)胞復(fù)蘇是一簡單的試驗(yàn)操作，但操作中有許多需要注意的事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小問題，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)保持良好。現(xiàn)將細(xì)胞復(fù)蘇的操作程序和注意事項(xiàng)總結(jié)如下。

1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射30 min以上，超凈臺開啟通風(fēng)10 min。

2. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃恒溫水浴鍋中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭，移入無菌操作臺內(nèi)。將10 ml左右新鮮培養(yǎng)基移入無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，備用。

3. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，輕搖冷凍管使其在快速全部融化，以70 % 酒精擦拭凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

4. 將細(xì)胞懸液移入已加培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5. 待細(xì)胞貼壁后（根據(jù)細(xì)胞種類貼壁時(shí)間不同，一般4小時(shí)左右），棄去含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

【注意事項(xiàng)】

1. 取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

2. 常溫下二甲基亞砜（DMSO）對細(xì)胞的毒副作用較大，因此，必須在1~2 min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)蘇溫度太低，會造成細(xì)胞的損傷，所以選擇40℃復(fù)蘇。

3. 貼壁細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)流程是將解凍后的細(xì)胞懸液先進(jìn)行離心，以去除冷凍保護(hù)液DMSO對細(xì)胞的損傷，但是離心也會對剛復(fù)蘇的狀態(tài)欠佳的細(xì)胞產(chǎn)生損傷。也有的實(shí)驗(yàn)操作是將解凍后的細(xì)胞懸液先直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。這可能使培養(yǎng)基中少量的DMSO對細(xì)胞造成損傷。

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